冷冻电镜单颗粒分析：数据处理全流程

冷冻电镜单颗粒分析（Single Particle Analysis, SPA）是解析生物大分子近原子分辨率结构的核心技术。本文梳理从显微照片到原子模型的完整流程，介绍各步骤的目的、常用软件与关键参数。

1. 流程总览

样品制备（冷冻制样）
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数据采集（Titan Krios / Glacios 等）
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① 预处理：运动校正 + CTF 估计
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② 颗粒挑选（Particle Picking）
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③ 2D 分类（筛除坏颗粒）
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④ 初始模型（Ab-initio）
   ↓
⑤ 3D 分类（异质性分析）
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⑥ 3D 精修（Refinement）
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⑦ 分辨率评估（FSC 曲线）
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⑧ 原子模型搭建与精修

2. 样品制备与数据采集

2.1 冷冻制样

• 将蛋白样品（浓度通常 0.5–5 mg/mL）施加到载网（holey carbon grid）
• 用 Vitrobot / Leica GP 等设备快速浸入液乙烷，形成玻璃态冰
• 理想冰厚：略薄于颗粒直径；冰太厚信噪比差，太薄颗粒易变形

2.2 数据采集

• 300 kV 电镜（Titan Krios）+ 直接电子探测器（Gatan K3 / Falcon 4）
• 超分辨率模式 + 剂量分配（total dose 约 40–60 e⁻/Ų）
• 每张照片（movie）通常 30–50 帧，用于运动校正
• 目标：10,000–20,000 张照片（高分辨率结构通常需要百万级颗粒）

3. 预处理（Preprocessing）

3.1 运动校正（Motion Correction）

电子束引起的样品漂移会模糊图像，需要按帧校正：

# RELION 4 中的 motion correction
relion_run_motioncorr \
  --i Micrographs/ \
  --o MotionCorr/ \
  --j 8 \
  --pipeline_control MotionCorr/job001/

常用软件：MotionCor2（经典）、RELION 内置、cryoSPARC Patch Motion Correction。

3.2 CTF 估计

CTF（Contrast Transfer Function，衬度传递函数）描述了电子显微镜成像的相位翻转与欠焦效应：

# CTFFIND4（经典命令行）
ctffind --input_micrograph MotionCorr/mic1.mrc \
        --output_diag mic1_diag.mrc \
        --defU 20000 --defV 20000

# Gctf（更快的 GPU 版本）
Gctf --input 'MotionCorr/*.mrc' --apix 1.0

常用软件：CTFFIND4、Gctf、cryoSPARC Patch CTF。

关键判据：分辨率截断（Resolution limit）通常取 3–4 Å；剔除 astigmatism 过大或漂移严重的照片。

4. 颗粒挑选（Particle Picking）

4.1 传统方法

• 模板匹配（Template-based）：用 2D 类平均做模板，相关性搜索
• 软件：RELION 的 auto-picking、cryoSPARC 的 Template Picker

4.2 深度学习方法（当前主流）

# Topaz：基于 CNN 的颗粒挑选
topaz train --model-path model.pkl --epochs 20 \
  --num-workers 4 --train-data particles.toml

topaz extract --model-path model.pkl \
  --micrographs micrographs.toml \
  --output-prefix picked --radius 100

主流工具：Topaz、crYOLO（速度极快，支持实时挑选）、cryoSPARC Blob Picker。

现代流程常先用 Blob/模板快速挑一批做 2D 分类，再用干净类平均训练 Topaz/crYOLO 模型，显著提升复杂样品（膜蛋白、小蛋白）的挑选质量。

5. 2D 分类：筛选颗粒

2D 分类将颗粒按投影方向聚类，同时剔除冰污染、错误挑选、变性颗粒：

# RELION 2D classification
relion_refine --o Class2D/ \
  --particle_images particles.star \
  --ctf --K 100 --iter 25 --tau2_fudge 4 \
  --flatten_solvent --zero_mask --pool 30 \
  --per_particle_ctf --j 8

质量判据：

• 类平均应显示清晰的二级结构（α 螺旋、β 片层）
• 保留占总量 50–80% 的"好"颗粒
• 好的类平均是后续 3D 重构质量的前提

6. 3D 重构：初始模型与分类

6.1 初始模型（Ab-initio）

无需参考模型，从随机起始重构：

# cryoSPARC
cryosparc_abinitio ... --num_classes 3

• 常用：cryoSPARC Ab-initio（速度快、稳健）、RELION 3D initial model
• 生成 2–4 个类，选择结构特征最清晰的类作为参考

6.2 3D 分类：处理构象异质性

生物样品常存在多个构象（开放/闭合、配体结合/未结合）：

# RELION 3D classification
relion_refine --o Class3D/ \
  --ref initial.mrc --K 4 --iter 40 \
  --tau2_fudge 8 --particle_diameter 200

策略：先粗分（K=4–6）看构象分布，再对感兴趣构象细分（K=2–3），最终每个 3D 类对应一个构象。

7. 3D 精修（Refinement）

7.1 常规精修

relion_refine --o Refine3D/ \
  --ref class3d.mrc --particle_diameter 200 \
  --auto_mask --solvent_mask \
  --ctf --per_particle_ctf --j 8

关键参数：

• C1 对称性起步，对称分子可指定 C/D/O 对称（如 C3、D7）
• 溶剂掩膜（solvent mask）必须使用，否则 FSC 虚高
• 局部精修（local refinement）处理柔性区域

7.2 贝叶斯抛光（Bayesian Polishing）

对 movie 帧级颗粒做轨迹拟合与加权，提升高频信息：

relion_polish --i Refine3D/run_data.star \
  --o Polish/ \
  --model_type 2 --nr_iter 5

7.3 各向异性校正（CTF refinement）

精修每个颗粒的欠焦、像散、束倾斜：

relion_ctf_refine --i Polish/particles.star \
  --o CtfRefine/ \
  --fit_defocus --fit_magnification --fit_tilt

8. 分辨率评估：FSC 曲线

FSC（Fourier Shell Correlation）：把颗粒随机分成两个半集（half-maps），分别重构后比较两图的相关系数：

• FSC = 0.143 准则：金标准分辨率判定（半图校正后）
• FSC = 0.5：保守估计（未校正）

relion_postprocess --i Refine3D/run_half1_class001.mrc \
  --mask mask.mrc --autob_masking \
  --angpix 1.0

质量检查表：

指标	良好标准
全局分辨率（FSC 0.143）	≤ 3.5 Å（高分辨）
颗粒数	≥ 10 万（3 Å 级通常需数十万）
方向分布	均匀（无 Preferred orientation）
密度连续性	侧链密度清晰可见（< 3 Å）

9. 常用软件栈对比

环节	RELION（命令行）	cryoSPARC（GUI）
运动校正	内置 / MotionCor2	Patch Motion
CTF	CTFFIND4 / Gctf	Patch CTF
挑选	模板 / Topaz 集成	Blob / Template / Topaz
2D/3D	稳定可靠	快、交互好
非均匀精修	—	NU-refinement（柔性大分子利器）

工作流建议：cryoSPARC 做预处理与初始重构，RELION 做高精度精修与抛光；或全流程 cryoSPARC（对新手更友好）。

10. 小结

• 预处理（运动校正 + CTF）决定数据质量上限
• 深度学习颗粒挑选（Topaz/crYOLO）显著提升复杂样品表现
• 2D 分类筛颗粒，3D 分类处理构象异质性
• 精修三件套：溶剂掩膜 + 贝叶斯抛光 + CTF refinement
• FSC = 0.143 是分辨率金标准

后续文章将介绍结构可视化（PyMOL/ChimeraX）与原子建模（Coot/phenix），把密度图变成原子模型。